近日，国家糖工程技术研究中心肖敏教授团队在透明质酸裂解酶的基因挖掘及理性改造方面取得重要进展，相关研究成果以“Discovery of Novel Endolytic Hyaluronate Lyases Belonging to a New Subfamily of GH56 and Enhancement of Catalytic Activity through Catalytic Cleft Engineering”为题发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊。山东大学国家糖工程技术研究中心博士生于湘钒为论文第一作者，肖敏教授为论文通讯作者，山东大学为第一作者单位和通讯作者单位。
透明质酸酶是一类可降解透明质酸（HA）生成低分子量透明质酸（LMW-HA）与透明质酸寡糖（Oligo-HA）的酶，其中部分酶对软骨素及硫酸软骨素也具有有限的催化活性。根据酶的催化机制，透明质酸酶可分为三类：第一类为透明质酸4-糖苷水解酶（EC 3.2.1.35），主要分布于真核生物，归属于糖苷水解酶家族GH16与GH56，水解透明质酸、软骨素、硫酸软骨素的β-1,4-糖苷键，生成还原端带有N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）或N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的四糖；第二类为透明质酸3-糖苷水解酶（EC 3.2.1.36），主要存在于水蛭体内，归属于糖苷水解酶家族GH79，特异性水解透明质酸的β-1,3-糖苷键，生成还原端带有葡糖醛酸（GlcUA）的四糖与六糖；第三类为透明质酸裂解酶（EC 4.2.2.1），多见于微生物，归属于多糖裂解酶家族PL8与PL16，通过β-消除反应断裂透明质酸的β-1,4-糖苷键，在产物非还原端的GlcUA残基上形成Δ4,5-不饱和双键，该结构在232 nm处存在特征紫外吸收。目前，真菌来源的透明质酸酶相关研究较少，酶的功能表征也不充分。GH56家族酶主要在脊椎动物和昆虫毒液中被发现，具备两种糖苷水解酶活性，即透明质酸内切-β-1,4-N-乙酰葡糖胺酶活性与软骨素内切-β-1,4-N-乙酰半乳糖胺酶活性，尚未有透明质酸裂解酶活性的报道，也未有真菌或细菌来源酶的报道。
本研究通过基因挖掘获得子囊真菌Sporothrix schenckii 1099-18来源的透明质酸降解酶SpskHL，通过HA降解产物谱和最终产物结构鉴定，将该酶鉴定为首例GH56家族内切型透明质酸裂解酶。AlphaFold2结构显示该酶为一种单结构域蛋白，其整体结构为GH56透明质酸酶经典的（β/α）8 TIM桶，其催化裂隙廓形狭窄，明显小于GH56家族已知晶体结构的来源于蜂毒液和人的透明质酸内切-β-1,4-N-乙酰葡糖胺酶HYA和Hyal-1的催化裂隙；丙氨酸扫描突变研究了该酶催化裂隙内−2至+2亚位点的15个氨基酸残基的作用，并针对位于+1位的GH56家族完全保守的2个催化活性位点D81和E83，构建了双突变酶D81A/E83A、单突变酶E83D和E83Q并测定其活性，结合分子动力学（MD）模拟计算分析解析了SpskHL酶可能的裂解催化机制；对该酶的3个有益丙氨酸突变进行组合突变，筛选获得三突变体SpskHLM3（Y120A/N125A/H189A）的催化活性提高了126%。进一步基因挖掘获得了4种SpskHL的同源酶，分别来源于子囊真菌Sporothrix bragantina的SpbHL、Ophiostoma piceae UAMH 11346的OpHL和Niveomyces insectorum RCEF 264的NiHL，以及来源于革兰氏阴性细菌Burkholderia lata的BlHL。AlphaFold2结构显示这4种酶均为单结构域蛋白，其整体结构也是GH56透明质酸酶经典的（β/α）8 TIM桶，它们的催化裂隙廓形也都明显狭窄；4种酶均以内切方式切割HA生成不饱和Oligo-HA，终产物为不饱和透明质酸二糖（ΔHA2），它们与SpskHL一起构成了GH56家族一个新的内切型透明质酸裂解酶亚家族（Subfamily）。最后将SpskHL的三位点突变移植到其他4种内切型透明质酸裂解酶中，获得了4种三突变酶的催化活性均提高了74%−155%。MD模拟分析表明，5种三突变酶均表现催化裂隙扩大、催化残基E附近空腔增大、酶与底物氢键形成频率增加以及催化残基E的OE2原子与透明质酸O4原子之间距离缩短的特征，这些变化均有利于底物结合，从而提高了催化活性。本研究结果不仅丰富了透明质酸裂解酶的多样性，为透明质酸降解及相关应用提供了潜在的酶工具，也加深了人们对GH56家族透明质酸裂解酶的认知，为后续该类酶的蛋白质改造提供指导。
国家糖工程技术研究中心肖敏教授团队长期从事糖链编辑工具酶的发掘及其应用，已经获得大量的糖链合成和降解工具酶，并开发了酶在功能和药用寡糖、肿瘤相关糖链、糖氨基酸/肽、天然产物或药物糖基化修饰、透明质酸寡糖/均质透明质酸制备中的应用，取得了系列成果。该项研究获得了国家重点研发计划、山东省重点研发计划以及“微生物+”校内联合项目基金资助等项目的支持。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6c11019
