近日，山东大学国家糖工程技术研究中心王倩教授课题组在谷氨酸棒杆菌质粒动态拷贝数调控方面取得重要突破，相关研究成果以“Reconfiguring antisense RNA-mediated replication enables modular and autonomous plasmid copy number control”为题发表于国际知名期刊 Chemical Engineering Journal（IF=13.4）。 糖中心研究生王格格，胥健萍，赵滕菲为共同第一作者，王倩教授为通讯作者，山东大学为第一作者单位和通讯单位。

在微生物细胞工厂的构建中，质粒是承载目标基因的核心工具，其拷贝数直接决定了基因表达剂量，进而影响产物产量与细胞代谢负荷之间的平衡。然而，在谷氨酸棒杆菌等革兰氏阳性工业菌中，广泛使用的滚环复制质粒依赖一种asRNA-RepA负反馈调控机制，该机制结构刚性强、难以从外部干预，导致质粒拷贝数长期无法实现动态、可调的精準控制，已成为制约菌株精准工程化的关键瓶颈之一。

针对这一挑战，研究团队首次在谷氨酸棒杆菌中建立了面向滚环复制质粒的动态、可调质粒拷贝数调控平台。以两种滚环复制质粒（pXMJ19和pECXK99E）为模型，通过asRNA关键区域突变及RepA蛋白Leu430位氨基酸突变，获得了一系列固定拷贝数变体（1-170拷贝/细胞）。 通过设计间苯二酚和香草酸两种正交诱导型人工asRNA基因回路，成功解耦原有刚性调控，实现了单质粒系统100→8拷贝的精细下调及双质粒系统150→1拷贝的接近完全复制关闭，首次实现了双向、宽幅度、可编程的动态PCN调控（1–150拷贝）。

研究团队将该平台应用于生物传感器的性能优化，龙胆酸和香草酸传感器的动态范围分别从1.9倍和1.83倍提升至49.2倍和4.49倍，动态范围最高提升近30倍；激活子型传感器随PCN增加单调提升，阻遏子型传感器在中等PCN处达到最优，为传感器设计提供了通用策略。在代谢工程中，通过PCN上调限速酶HemA使5-ALA产量提升2.3倍，正交调控dxs与crtEBI模块使番茄红素产率提高2.5倍。在木质素转化中，香草酸积累可激活动态PCN系统上调限速酶VanAB，自主调控系统实现了更优的原儿茶酸产量（5.09 g/L）和更高生产强度（0.24 g/L/h），实现了胞内代谢物自发驱动质粒扩增的智能自调控。本研究首次为革兰氏阳性菌滚环复制质粒建立了通用、精准、模块化的动态PCN调控平台，并在生物传感与代谢工程中验证了其多重功能。这一“基因剂量调节器”丰富了工业菌种的调控工具箱，为下一代智能生物制造系统提供了新的技术路径与思路。

图 谷氨酸棒杆菌质粒拷贝数动态调控的整体设计思路

该项研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金以及微生物改造技术全国重点实验室院内联合项目基金的资助。山东大学生命环境研究公共技术平台为本工作提供了重要支持。

文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894726043391